Le film s’ouvre sur Peter Parker, qui écrit une lettre à MJ dans l’espoir de pouvoir un jour la lui remettre et lui expliquer ce qui s’est passé entre eux. Depuis que le Docteur Strange a lancé un sort faisant oublier son existence à tout le monde, Peter se consacre entièrement à sa vie de Spider-Man. Au cours des quatre années suivantes, il affronte notamment Mac Gargan, alias le Scorpion, Tombstone, Boomerang, Tarantula et la Main, tout en collaborant avec l’inspectrice Jean DeWolff. À distance, il continue également d’observer MJ et Ned, qui étudient désormais ensemble au MIT.
À Manhattan, Spider-Man se lance à la poursuite d’un char hors de contrôle, également traqué par Frank Castle, le Punisher. Après avoir empêché Frank de poursuivre le véhicule, Spider-Man tente d’arrêter le char avant qu’il ne percute un bâtiment du Department of Damage Control. À l’intérieur, il découvre une vieille femme contrôlée télépathiquement. L’individu qui la manipule transfère alors son esprit dans le corps d’un garde et parvient à modifier l’ordre de transfert du Scorpion, qui doit être envoyé à Bellevue plutôt qu’au Raft. Avant de s’échapper, le télépathe révèle à Spider-Man qu’une bombe se trouve dans le char. Peter ne parvient pas à empêcher l’explosion, mais le bâtiment est évacué à temps.
DeWolff apprend ensuite à Spider-Man que le Scorpion a été libéré de Bellevue. À la recherche d’informations sur le mystérieux responsable de ces événements, Peter se rend dans un établissement de bains russe où il rencontre Yelena Belova. Celle-ci lui révèle que le Damage Control a déjà subi quatre attaques et que quelqu’un cherche quelque chose appelé « V-Max ».
Spider-Man se rend alors au quartier général du Damage Control et rencontre son directeur, Bill Metzger. Il découvre que des ninjas de la Main travaillent pour l’organisation. Metzger affirme ignorer l’identité du responsable des attaques ainsi que la signification de « V-Max », mais Peter comprend que ce que recherche leur adversaire se trouve probablement derrière une immense chambre forte.
Plus tard, alors qu’il téléphone à DeWolff, Peter aperçoit Ned et le suit jusqu’à l’appartement qu’il partage avec MJ, où une fête est organisée. Il découvre que Ned élabore différentes théories sur l’identité de Spider-Man et a même développé une application permettant de suivre ses déplacements. Peter retrouve MJ et lui offre des fleurs qu’il comptait initialement déposer sur la tombe de tante May. Mais lorsqu’il voit MJ embrasser un autre homme, il quitte les lieux, bouleversé. Une fois rentré chez lui, Peter est soudainement pris d’une violente douleur avant de perdre connaissance.
À son réveil, il se retrouve enfermé dans un cocon de toile à l’extérieur de son appartement. Il découvre que son organisme produit désormais naturellement des toiles et que ses lance-toiles artificiels ne fonctionnent plus. Son assistante d’intelligence artificielle, E.V., lui apprend que son corps et son ADN sont en pleine mutation : ses caractéristiques arachnéennes se développent davantage et provoquent notamment une surcharge de ses sens.
Après avoir commencé à maîtriser ces nouvelles capacités, Spider-Man affronte de nouveau le Scorpion lors d'une attaque contre le Damage Control. D’abord dominé, Peter finit par laisser ses instincts arachnéens prendre le dessus et devient extrêmement violent. Il arrache la queue du Scorpion, mais blesse grièvement un policier au cours du combat. Il comprend ensuite que son adversaire était lui aussi contrôlé par le mystérieux télépathe et réalise avec horreur ce qu’il vient de faire.
Peter sollicite alors l’aide du docteur Bruce Banner, devenu professeur de physique et portant désormais un inhibiteur au poignet afin d’empêcher sa transformation en Hulk. Peter lui demande des conseils pour fabriquer son propre inhibiteur ainsi qu’un dispositif universel susceptible de fonctionner sur n’importe qui. Il retourne ensuite chez lui et construit un appareil pour contrôler ses nouvelles mutations, ainsi qu’un second destiné au télépathe.
Celui-ci contacte bientôt Peter et le provoque en affirmant qu’il va s’en prendre à MJ. Spider-Man parcourt la ville en suivant les personnes successivement contrôlées et finit par déterminer que le pouvoir de son adversaire possède une portée d’environ dix mètres. Lorsque le télépathe prend le contrôle d’un pilote d’hélicoptère, Spider-Man immobilise l'appareil avec ses toiles.
Peter rejoint ensuite MJ et la convainc de partir avec lui. Sur un toit, elle semble progressivement retrouver ses souvenirs de leur relation. Elle retire le masque de Spider-Man et l’embrasse, donnant à Peter l’espoir que sa mémoire est revenue. Mais il découvre qu’il s’agit d’une cruelle manipulation du télépathe, qui contrôle MJ et la force à se jeter du bâtiment. Peter réussit à la rattraper, mais elle perd connaissance. Il finit alors par apercevoir la véritable personne qui se cache derrière ces attaques : une adolescente.
Peter emmène MJ dans la cachette de Frank Castle. Après quelques tensions, Frank accepte de la protéger. Spider-Man analyse le visage de la jeune télépathe et découvre que la plupart des informations la concernant ont été effacées, mais parvient néanmoins à obtenir son identité : Jean Elaine Grey. Avec l’aide de MJ, il améliore son inhibiteur et prépare celui qu’il compte utiliser contre Jean.
Jean attaque une nouvelle fois le Damage Control. MJ convainc Frank d’aller aider Spider-Man, tandis que Metzger rassemble ses hommes dans une pièce sécurisée. Peter découvre alors que Jean contrôle Bruce Banner après lui avoir retiré son inhibiteur. Redevenu Hulk, Bruce affronte Spider-Man et Frank. Ils réussissent à libérer son esprit de l’influence de Jean, mais quelque chose semble s’être brisé en lui et il se transforme en une version encore plus imposante et incontrôlable de Hulk. Spider-Man tente de limiter les dégâts avant de parvenir à lui faire retrouver ses esprits en lui rappelant leur amitié.
Jean prend ensuite le contrôle de Frank et utilise ses explosifs pour détruire la chambre forte. Spider-Man intervient avant qu’elle ne puisse tuer Metzger et utilise son inhibiteur pour libérer Frank de son emprise. Metzger neutralise finalement Jean avec une fléchette tranquillisante. Juste avant de perdre connaissance, elle murmure un seul prénom : « Sara ».
Bruce est conduit à l’hôpital tandis que Jean est placée en détention. Lorsque Spider-Man interroge Metzger au sujet de Sara, celui-ci prétend qu’il s’agissait d’une collègue récemment décédée dont Jean aurait découvert l’existence en fouillant dans son esprit.
De retour dans la cachette de Frank, Peter découvre que MJ a trouvé la lettre qu’il lui avait écrite. Il est alors contraint de lui révéler son identité ainsi que l’histoire qu’ils ont vécue ensemble. Peter lui avoue qu’il l’aime, mais MJ lui répond qu’elle ne ressent pas la même chose puisqu’elle n’a aucun souvenir de leur relation. Malgré son chagrin, Peter accepte sa décision et la raccompagne chez elle. Elle lui permet néanmoins de rencontrer Ned, ravi de faire enfin connaissance avec son héros.
Une remarque de MJ change cependant la situation : elle ne garde aucun souvenir du moment où Jean la contrôlait lorsqu’elle a embrassé Peter. Celui-ci comprend alors que Metzger a menti lorsqu’il affirmait que Jean avait découvert Sara dans ses souvenirs. Yelena révèle ensuite à Peter que de nombreuses informations concernant Jean ont été supprimées par le Damage Control et que Sara était en réalité la sœur de Jean. Peter comprend immédiatement que celle-ci est en danger.
Un retour en arrière révèle que Jean et Sara ont été abandonnées par leur mère après l’apparition de leurs pouvoirs mutants. Sara avait appris à Jean à transférer son esprit d’une personne à l’autre. Un jour, une équipe du Damage Control dirigée par Metzger est venue arrêter Sara. Jean avait tenté d’intervenir, mais sa sœur l’en avait empêchée.
Au Damage Control, Metzger attache Jean à une chaise et active un dispositif destiné à mesurer la portée maximale de ses pouvoirs. Jean découvre alors que « V-Max » correspond en réalité à quelque chose que Sara avait aperçu depuis le système de ventilation. Elle comprend que sa sœur est morte à la suite des expériences menées sur elle. Jean retire son inhibiteur et libère une immense onde psychique à travers New York, paralysant presque toute la population de la ville, dont MJ et Ned.
Frank, situé juste en dehors de la zone d’effet, se prépare à abattre Jean avec un fusil de précision. Spider-Man rejoint quant à lui le Damage Control, où il affronte les ninjas de la Main contrôlés par Jean. Submergé, Peter décide de retirer son propre inhibiteur et d’accepter pleinement l’évolution de ses pouvoirs. Il affirme qu’il peut être à la fois Peter Parker et Spider-Man, puis parvient à vaincre ses adversaires et à pénétrer dans la pièce où Jean retient Metzger.
Alors que Jean s’apprête à tuer Metzger avec des éclats de verre et que Frank prend position pour tirer, Peter permet volontairement à Jean d’entrer dans son esprit. Elle y découvre un souvenir de tante May parlant à Peter. À travers ce souvenir, Jean se retrouve symboliquement à la place de Peter et entend May lui rappeler qu’elle n’est pas seule. Peter lui fait comprendre qu’il sait ce que signifie perdre quelqu’un que l’on aime. Jean finit par abandonner sa colère.
Frank tire néanmoins. Peter pousse Jean hors de la trajectoire de la balle et reçoit le projectile à sa place. Jean utilise ses pouvoirs pour le maintenir en vie tandis que Frank l’emmène d’urgence à l’hôpital. Dans toute la ville, les habitants attendent avec inquiétude des nouvelles de Spider-Man.
Peter finit par se réveiller avec Frank à son chevet. Celui-ci regrette profondément de l’avoir blessé et reconnaît que les deux hommes sont désormais amis. Pour permettre à Peter de quitter discrètement l’hôpital, Frank enfile le masque et les gants de Spider-Man et apparaît à la fenêtre devant la foule. Peter découvre alors toute l’affection que les habitants de New York <span data-mce-type="bookmark" style="display: inline-block; width: 0px; overflow: hidden; line-height: 0;" class="mce_SELRES_start"></span>portent à Spider-Man. De son côté, MJ porte toujours le collier du Dahlia noir que Peter lui avait autrefois offert et esquisse un sourire.
Jean quitte finalement la ville en bus. DeWolff informe Peter que Metzger a disparu et que la police enquête désormais sur le Damage Control. Elle se réjouit également de voir que Spider-Man n’est plus aussi seul qu’autrefois, tout en l’encourageant à prendre du repos. Peter retrouve ensuite Ned et reproduit avec lui leur ancienne poignée de main secrète. La réaction de Ned laisse penser que certains de ses souvenirs de Peter commencent à refaire surface.
Après le générique, l’application de suivi de Spider-Man créée par Ned perd le signal du héros sur Terre. Le système étend alors sa recherche jusqu’aux confins de l’espace, où le signal réapparaît.
